CRISPR/Cas9 – nádej aj pre neliečiteľné zriedkavé ochorenia

V decembri 2023 Európska lieková agentúra (EMA) schválila uvedenie lieku Casgevy na trh, ktorý je určený na liečbu vrodených porúch červených krviniek – závažných prípadov kosáčikovitej anémie a beta talasémie. Je to jednak míľnik pre pacientov s týmito ochoreniami. Ale nemenej dôležité je, že je to prvá schválená liečba využívajúca technológiu CRISPR/Cas9 na editovanie génov. CRISPR/Cas9 je biochemický systém izolovaný z baktérií, pričom v roku 2012 vedkyne Jeniffer Doudna a Emmanualle Charpentier objavili spôsob, ako ho využiť pre cielené editovanie (prepis) DNA. Za tento objav im bola v roku 2020 udelená Nobelova cena za chémiu. CRISPR/Cas9 má obrovský dopad najmä vo vedeckom výskume a schválenie prvých liekov prináša nádej na jeho využitie v klinickej praxi, pričom by potenciálne mohol priniesť liečbu pre množstvo najmä genetických ochorení.

Na úvod by sme radi upozornili, že terminológia v tejto oblasti môže byť čiastočne nejasná, až zavádzajúca. Ako je podrobnejšie popísané nižšie,  CRISPR/Cas9 je funkčný komplex sekvencií DNA (pričom CRISPR sa samostatne vyskytuje iba v baktériách) a proteínu Cas9. Samotný CRISPR sa teda v biotechnológiách ani v medicíne nevyužíva, ale iba Cas9 (alebo podobný Cas proteín). Bežne používaný termín CRISPR/Cas9 sa spravidla reálne vzťahuje iba ku Cas9 (v angličtine sa niekedy na opis liekov založených na Cas9 tiež používa termín „crispr therapeutics“). V širšom zmysle je možné liečbu využívajúcu  CRISPR/Cas9 označovať ako liek. Ale je vhodné uvedomiť si, že sa môže jednať o zložitejšie postupy zahŕňajúce napr. odobratie tkaniva z organizmu, a preto sa niekedy používajú aj iné termíny ako „CRISPR/Cas9 terapia“, na odlíšenie od liekov s bežnými spôsobmi podania (ako sú napr. perorálne tablety).

Objavy vedúce ku CRISPR/Cas9 a editácií génov

Ako zdôraznila pri preberaní Nobelovej ceny aj Jeniffer Doudna, na výskume CRISPR/Cas9 sa podieľalo mnoho vedcov z viacerých krajín a je to príbeh, ktorý sa začal už pred niekoľkými desaťročiami.  Niektoré bakteriálne gény patriace ku CRISPR (tento názov sa vtedy ešte nepoužíval) boli prvý krát opísané pravdepodobne na univerzite v Osake v roku 1987, ale ich výskumu sa tam vtedy nevenovala ďalšia pozornosť. Intenzívnejší výskum sa začal v polovici 90-tých rokov, keď španielsky vedec Francisco Mojica identifikoval súbor génov, ktorý práve on pomenoval ako CRISPR (skratka pre Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) a správne predpokladal, že ich funkciou je ochrana baktérií pred vírusovou (bakteriofágovou) infekciou.

Jednou z prvých baktérií, kde bol CRISPR pozorovaný a skúmaný, bol Streptococcus thermophilus, čo je baktéria využívaná v potravinárstve pri výrobe mliečnych výrobkov a k výskumu významne prispeli aj vedci zaoberajúci sa potravinárskymi biotechnológiami. Francúzski vedci z oblasti potravinárstva zistili, že CRISPR spolupracuje s enzýmami štiepiacimi DNA (nukleázami) a vytvára komplex, ktorý označili ako CRISPR/Cas9. Litovský vedec Virginijus Šikšnys preniesol CRISPR/Cas9 do baktérie Escherichia coli a dokázal, že systém je schopný samostatne fungovať v inom organizme. Najvýznamnejšie objavy súvisia s využitím CRISPR/Cas9 na editovanie génov a podieľali sa na nich spomínané vedkyne  Jeniffer Doudna a Emmanualle Charpentier počas ich spolupráce na University of California v Berkeley.

Vedecký článok opisujúci ich objav bol publikovaný vo vedeckom časopise Science v auguste 2012. CRISPR/Cas9 predstavoval výrazný pokrok oproti starším technológiám editovania (Zinc-finger proteázy, TALEN) a rýchlo našiel široké uplatnenie v molekulárnej biológii, keďže umožňoval pomerne presné génové manipulácie prakticky všetkých modelových organizmov (vo výskume používané organizmy od baktérií, cez rastliny, po laboratórne zvieratá) a napomohol výskumu funkcie génov. Viacerí vedci začali pracovať na využití CRISPR/Cas9 v medicíne. Nadväzujú pri tom na predchádzajúci výskum génovej terapie, keď chcú CRISPR/Cas9  využiť na nápravu nesprávne fungujúcich génov pri genetických poruchách.

(Prednáška o CRISPR/Cas9 pri preberaní Nobelovej ceny za chémiu.)

Štruktúra a funkcia CRISPR/Cas9

Komplex CRISPR/Cas9 bol nájdený približne u 50 % baktérií, pričom jeho funkcia je analógiou jednoduchého imunitného systému, ochraňujúceho bakteriálnu bunku pred vírusovou infekciou. Baktéria si po infekcii vírusom uloží časť vírusovej DNA do vlastného genómu, do oblasti označovanej ako CRISPR. V CRISPR oblasti sú krátke pravidelne sa opakujúce segmenty DNA striedajúce sa s tzv. spacerami. Pričom spacery sú práve segmenty DNA pôvodom z vírusu, ktorý infikoval baktériu. Pri každej ďalšej infekcii môže baktéria potenciálne vytvoriť ďalšie spacery. CRISPR segmenty sú prepisované do RNA, ktoré sa označujú ako CRISPR RNA (crRNA). crRNA funkčne spája CRISPR s tzv. CRISPR asociovanými systémami, skrátene označovanými ako Cas (CRISPR-associated systems).

Cas sú proteíny, ktorých funkcia súvisí s modifikáciou DNA, majú napr. nukleázovú alebo helikázovú aktivitu. Je známych viacero Cas proteínov (označujú sa číslom ako Cas3, Cas9, Cas13 atď.), najvýznamnejší z nich je Cas9, ktorého modifikovaná forma sa najčastejšie používa ako technológia editovania génov. Hlavnou funkciou Cas je pomocou crRNA nájsť vírusovú DNA v bakteriálnej bunke a eliminovať ju (štiepiť, „rozstrihnút“) a tým zneškodniť vírus. Keďže ako sme uviedli je viacero druhov Cas proteínov, v detailoch sa ich mechanizmy pôsobenia môžu líšiť. Napríklad proteín Cas13, vyskytujúci sa u baktérie Leptotrichia shahii neštiepi DNA ale RNA (pripomína RNA interferenciu).

Sústredíme sa ale najmä na modifikovaný Cas9, ktorý má najväčší biotechnologický význam. Modifikovaný Cas9 systém nevyužíva CRISPR segmenty a crRNA, tá je vymenená za syntetickú „vedúcu“ RNA (guide RNA, gRNA). gRNA dokáže naviesť Cas9 k akejkoľvek sekvencii v genóme a je teda navrhnutá podľa toho, ktorú DNA sekvenciu má zasiahnuť (napríklad v špecifickom géne, ktorý chceme ovplyvniť). Po navedení sa Cas9 naviaže na cielený úsek DNA a ďalej sa chová rovnako – teda DNA na danom mieste enzymaticky rozštiepi. Opravné mechanizmy DNA následne rozštiepený úsek opäť spoja, ale keďže táto oprava DNA nepracuje úplne presne, často vnesú do DNA zmenu poradia nukleotidov, teda mutáciu, ktorá môže ovplyvniť funkčnosť celého génu.

Najčastejším dôsledkom je potom strata funkcie, inaktivácia génu („gene knockout“). Cas9 je možné ďalej modifikovať, napríklad fúziou s ďalšími enzýmami tak, aby vzniknuté mutácie boli viac cielené. Napríklad enzým deamináza zamení cytidín za tymidín (v DNA sekvencii zamení C za T). Tiež je možné do bunky dopraviť DNA reparačný templát, aby podľa neho reparačné enzýmy opravili DNA. Fúziou Cas9 s génovými promótormi je možné ovplyvňovať expresiu génov, alebo fúziou s fluorescenčnými proteínmi (s použitím ďalších techník) vizualizovať ich polohu na chromozóme.

Pre potenciálne využitie pri liečbe genetických ochorení z toho vyplýva, že CRISPR/Cas9 je omnoho ľahšie využiť na inaktiváciu génu (čo je menej častý prípad medicínsky potrebnej modifikácie) ale pre dosiahnutie presnej zmeny v poradí DNA nukleotidov (oprava mutovaného génu) väčšinou nie je systém zatiaľ dostatočne presný. Preto uplatnenie v medicíne je dosť závislé aj od toho, ako sa podarí pri CRISPR/Cas9 vylepšiť jeho presnosť, špecificitu.

Využitie, potenciál v medicíne a možné riziká

CRISPR/Cas9 má široké využitie vo vedeckom výskume v oblasti molekulárnej biológie a genetiky, najmä pri štúdiu funkcie génov a modelov genetických porúch, vo výskume je to už bežne používaná metóda. Tiež samotný systém CRISPR/Cas9 je predmetom pokračujúceho výskumu a optimalizácie a tento pomerne nový systém je naďalej vylepšovaný. Napríklad sa viac skúma  využitie ostatných Cas proteínov (namiesto Cas9).

Využitie mimo vedeckého výskumu má veľký potenciál a rýchlo sa rozširuje, ale zatiaľ je pomerne obmedzené. CRISPR/Cas9 je možné využiť v molekulárnej diagnostike – v tomto prípade systém neslúži na editáciu, ale na detekciu špecifických úsekov DNA (napr. pri hľadaní mutácií, polymorfizmov alebo dôkazu prítomnosti patogénov, ako sú vírusy, baktérie vo vzorke). V diagnostike sa zatiaľ používa v obmedzenej miere. Náklady na analýzu pomocou CRISPR/Cas9 sú v súčasnosti v porovnaní s PCR (polymerázovou reťazovou reakciou) niekoľkonásobne vyššie, ale v niektorých prípadoch je ale vhodnejšie použiť CRISPR/Cas9.

Asi najvyššou ambíciou vedcov pracujúcich s CRISPR/Cas9 je priniesť novú, účinnú liečbu najmä genetických ochorení a schválenie lieku Casgevy je v tomto smere aj obrovským povzbudením. V súčasnosti je známych viac ako 6000 monogénových ochorení (spôsobených poruchou v jednom géne), ktoré by CRISPR/Cas9 potenciálne mohol trvalo napraviť. „Oprava“ chybne fungujúceho génu pri genetických poruchách sa označuje ako génová terapia, pričom CRISPR/Cas9 je jedným z jej možných prístupov. Výrazným impulzom pre výskum v oblasti génovej terapie bolo dokončenie projektu ľudského genómu (Human Genome Project, HGP), oficiálne v roku 2003. Nasledovalo obdobie spojené s veľkým optimizmom, keď mnohí vedci a lekári dúfali, že keď je už známe miesto génov v ľudskom genóme, tak je to už iba malý krok k liečbe genetických porúch.

Schválených je 20 liekov génovej terapie

V súčasnosti, o dve desaťročia neskôr, je ale schválených iba zopár (okolo 20) liekov génovej terapie. Génová terapia samozrejme účinkuje na úrovni DNA, ktorá sa nachádza v bunkových jadrách a najväčším problémom sa ukázal byť transport či už DNA, alebo proteínových komplexov (ako CRISPR/Cas9) do buniek, keďže bunky disponujú mechanizmami, ako sa brániť ich preniknutiu z vonkajšieho prostredia. Nástroje transportu do buniek sa označujú ako vektory a najčastejšie sa používajú vírusové (modifikované vírusy) alebo lipidové vektory. Historicky boli viac využívané  vírusové vektory, ale niektoré najnovšie objavy ako potvrdenie vzťahu EB vírusu a rozvoja mnohopočetnej sklerózy (sclerosis multiplex) a podozrenie na vplyv vírusov na rozvoj neurodegeneratívnych ochorení (ako Alzheimerova alebo Parkinsonova choroba) prinášajú väčšiu opatrnosť až neochotu používať v génovej terapii vírusové vektory.

Nájsť vhodné vektory, spôsob transportu do tkanív a buniek je jedna z výziev s ktorými sa CRISPR/Cas9 bude musieť vysporiadať. Jedným z riešení, ako tento problém čiastočne obísť, je spôsob podania „ex vivo“, čo znamená mimo organizmu a uplatňuje sa pri viacerých liekoch génovej terapie. Je to aj prípad Casgevy, pre ktorý sú cieľové bunky v kostnej dreni, ktoré sú ako jediné schopné vytvárať červené krvinky. V tom prípade sa pacientovi odoberie časť kostnej drene, mimo organizmu sú jeho bunky kostnej drene vystavené pôsobeniu lieku a bunky (s opraveným génom pre tvorbu červených krviniek) sú mu spätne implantované. Takto je možné ľahšie mimo organizmu manipulovať aj s inými druhmi buniek, napríklad s B-lymfocytmi pri CAR T bunkovej terapii (Chimeric Antigen Receptor T cell).

Tento prístup sa samozrejme dá uplatniť iba pri niektorých málo ochoreniach, keďže s väčšinou tkanív nie je možné manipulovať mimo organizmu. Rizikom pri CRISPR/Cas9 je aj možnosť, že zasiahne podobné sekvencie DNA na iných miestach genómu („off-target effect“), čo môže potenciálne viesť k vzniku mutácií a čo je dôležitý možný nežiadúci účinok. Predmetom výskumu zostáva najmä dosiahnutie vyššej špecificity a spôsoby transportu do cieľových tkanív a následne do buniek. Aj keď na úrovni bunkovej kultúry zasiahnuť chybný gén už vďaka CRISPR/Cas9 nie je veľký problém, na úrovni organizmu je potrebný pre účinnú liečbu cielený transport do postihnutých tkanív, a ak taký transport nie je možný, v tých prípadoch ani nie je možné CRISPR/Cas9 v génovej terapii využiť.

Vývoju liečby založenej na CRISPR/Cas9 sa venuje viacero farmaceutických firiem a mnoho vedcov. Tento prístup sa skúma pri mnohých ochoreniach, nie len monogénových, ale napríklad aj pri rakovine alebo infekčných ochoreniach. Viaceré lieky sú v skorších (I a II) fázach klinického skúšania.

• V tretej fáze skúšania je liečivo NTLA-2001 s predpokladaným ukončením štúdie v roku 2027.  NTLA-2001 je určené na liečbu familiárnej amyloidnej kardiomyopatie (FAC). Po intravenóznom podaní inhibuje expresiu transtyretínu a tým bráni jeho patologickej akumulácii v srdci.
• Viacero štúdií sa venuje možnosti liečby lymfómov, keďže je pri nich možné podanie „ex vivo“. Patrí medzi ne napríklad druhá fáza skúšania liečiva ET-02 spoločnosti Edigene alebo klinické štúdie CRISPR Therapeutics AG.
• V druhej fáze klinického skúšania sú aj ďalšie  CRISPR/Cas9 lieky určené na liečbu beta-talasémie a kosáčikovitej anémie (Editas Medicine, Shanghai Vitalgen Biopharma), ktoré ak sa dostanú na trh, budú konkurenciou pre už schválené lieky.
• V prvej alebo druhej fáze klinického skúšania sú lieky pre viaceré zriedkavé genetické ochorenia ako Leberova kongenitálna amauróza, pigmentová retinopatia, hemofília, mukopolysacharidóza, fenylketonúria, Duchennova svalová dystrofia. Okrem toho samozrejme prebieha aj mnoho predklinických štúdii pri viacerých ďalších ochoreniach.
• Príkladom CRISPR/Cas9 liečby pri infekčných ochoreniach je EBT-101 spoločnosti Excision BioTherapeutics s pozitívnymi výsledkami druhej fázy pri liečbe HIV infekcie. HIV je RNA retrovírus, ktorý sa integruje do ľudského genómu. HIV spôsobuje chronickú infekciu, ktorú je v súčasnosti už možné účinne potláčať antiretrovirotikami a inhibitormi integráz, ale liečba musí byť dlhodobá (inak sa HIV opäť začne replikovať).  CRISPR/Cas9 otvára cestu odstránenia integrovaného HIV z ľudského genómu a prípadného úplného vyliečenia HIV.

CRISPR/Cas9 je možné a technicky pomerne jednoduché použiť na editáciu génov embryí, vrátane ľudských. V známom kontroverznom prípade z roku 2018 čínsky vedec He Jiankui, upravil gén CCR5 (ktorého modifikácia výrazne znižuje riziko infekcie vírusom HIV) minimálne dvoch embryí, z ktorých sa následne narodili deti. Tento experiment bol prijatý veľmi kriticky a to z viacerých dôvodov. CRISPR/Cas9 je relatívne nová technológia a má aj známe riziká, nežiadúce účinky, vrátane možného poškodenie genómu. Ak poškodenie nastane na úrovni embrya, tak sa prenáša na všetky bunky daného jedinca, ale aj ďalej do pohlavných buniek (do zárodočnej línie) a na jeho prípadné potomstvo.

Bioetické dilemy

CRISPR/Cas9 nie je v súčasnosti považovaná za úplne bezpečnú a preskúmanú technológiu na tak zásadné zásahy. Okrem toho tento experiment prináša mnohé bioetické dilemy. Samotná manipulácia s ľudskými embryami je prísne regulovaná, aj keď medzi krajinami sú rozdiely a prístup v Číne (resp. v Ázii) je menej striktný ako v západných krajinách. Úprava CCR5 nie je liečbou, ale „vylepšením“. Podľa niektorých názorov je vývoj, v ktorom by ľudia sami vylepšovali svoj genóm nežiadúci (aj ak by technológia bola úplne bezpečná a vedeli by presne predvídať dôsledky úprav na molekulárnej úrovni).

V stručnosti sú s týmto experimentom spojené tri hlavné problémy: CRISPR/Cas9 technológia zatiaľ nie je dostatočne overená a zásahy do zárodočnej línie a „vylepšenia“ genómu sú bioeticky problematické. Z týchto dôvodov podobný výskum neprebieha, žiadna firma ani výskumné centrum verejne nedeklaruje, že by sa usilovali o editáciu génov ľudských embryí a vo väčšine krajín by taký postup bol pravdepodobne nelegálny. Je vhodné zdôrazniť, že oproti tomu použitie CRISPR/Cas9 na liečbu ochorení (na úrovni somatických buniek s nesprávne fungujúcim génom) je bioeticky plne akceptované, považované za prínosný spôsob liečby.

Vývoj nových liekov je samozrejme časovo aj finančne náročný. Celkové náklady od laboratórneho výskumu po uvedenie nového lieku na trh sú väčšinou jedna až dve miliardy dolárov. To sa pochopiteľne odráža aj na cenách novej, inovatívnej liečby a ešte výraznejšie je to pri zriedkavých ochoreniach, keď je trhom malá pacientska populácia. Cenotvorba farmaceutických firiem môže byť aj oprávnene vnímaná kontroverzne, ale farmaceutické spoločnosti taktiež musia splatiť náklady ktoré investovali do výskumu.

Genetická alebo iná diskriminácia je amorálna

V skutočnosti je do ďalšieho výskumu investovaná aj veľká časť ich ziskov a bez investícií nie je možný ani medicínsky pokrok. Na druhej strane zdravotné poisťovne majú farmakoekonomické nástroje na objektívne zhodnotenie liečby (napr. na základe QALY) a nová liečba samozrejme prináša nie len vyššiu kvalitu života, ale aj ekonomické úspory či už udržaním zdravotného stavu pacientov (znížením nákladov na inú liečbu), alebo zvýšením ich ekonomickej produktivity.

V prípade  CRISPR/Cas9 liekov je ich výhodou, že by vo väčšine prípadov mali priniesť liečbu – nápravu genetickej poruchy jednorázovým podaním. Tiež cena lieku je zvyčajne najvyššia pri  uvedení na trh a má tendenciu časom, s nástupom konkurencie a generík (biosimilars) klesať. Základným argumentom by však mal byť bioetický pohľad, keď má každý nárok na dostupnú liečbu a genetická alebo iná diskriminácia je amorálna. V tomto kontexte má Slovensko v rámci EU žiaľ nedôstojné postavenie, keď patrí medzi krajiny s najhoršou dostupnosťou inovatívnych liekov.

CRISPR/Cas9 je revolučná technológia a jej príbeh v oblasti medicíny je iba na začiatku. Minulosť nás varuje aj pred prehnanými očakávaniami, ale potenciál, ktorý prináša v niektorých ohľadoch, nemá obdobu a v súčasnosti je to najvhodnejší prístup pre liečbu zriedkavých monogénových ochorení. Vývoj nových liekov trvá roky a niekedy aj desaťročia a to je približne časový rámec, kedy budeme vidieť, ako sa možnosti ktoré prináša CRISPR/Cas9 napĺňajú.

Autor: PharmDr. Vladimír Patráš

Zdroj: Časopis Lekárnik, ročník XXIX., číslo 4, apríl 2024

Zdroj foto: www.pixabay.com